编者引言
ELISA这项经典技术已占有多年的发展汗青，有多种步骤类型，竞争性ELISA技术就是其中一个根基类型，它同夹心ELISA法技术一样，也被利用到药物PK分析钻研中；若何基于竞争性ELISA道理构建好一个竞争性 Assay并在步骤成立实际中把握好有关重点，对整个步骤的最终成功尤为重要。作者结合自身实际体味与案例以此文略作论述，供各人参考。
ELISA技术自从上世纪70年代提出以来，经过几十年的发展，业已成为生物医药研发领域不成或缺的经典技术。ELISA步骤有各类分歧类型的分类大局，基于反映道理和模式可重要分为直接法、间接法、夹心法及竞争法，其它基于分歧的分子象征大局、载体大局、捕获大局或信号产生大局等等的步骤如荧光法、化学发光法、电化学发光法、类芯片法、微球法都是这4种根基步骤的组合或衍生。
其中，夹心法在大分子药物如抗体、蛋白药物的PK分析领域里得到了宽泛利用。而对于幼分子化合物或分子量偏幼的多肽药物，除了LC-MS/MS可进行它们的PK分析表，竞争性ELISA步骤也能够阐扬其特有的利用价值和优势。不仅如此，即便是分子量较大的蛋白及抗体在实际中也依然能够思考选取竞争性ELISA法进行有关的PK分析。因而，从可被利用的药物分子类型广度看，竞争法是在药物PK分析领域中最具使用潜能的一种ELISA步骤。
迄今数量繁多的现代药物中，幼分子药物占据着绝大无数，很多幼分子化合物是不具免疫原性但具免疫反映性的半抗原，如常与大分子抗体偶联的作为ADC的Payload的细胞毒素，部门激素等。
多肽也是现代药物中举足轻重的一部门，例如常见部门激素药物为多肽，另如肿瘤新生抗原肽近年还成为药物开发的一个热点。多肽分子量相对于化合物而言比力大，相对于抗体、重组蛋白或融合蛋白，其分子量则又很幼，往往不足较为复杂的二级结构或空间结构等，免疫原性较弱，是类半抗原物质。这些半抗原或类半抗原分子在理论上自身单独不能或难以刺激机体产生抗体，但在偶联了载体抗原分子后再免疫动物能够造备出与该分子自身进行结合反映的抗体，从而为构建对其进行ELISA测定的步骤提供工具性试剂。
这些半抗原分子很幼，往往其实仅有一个表位，不能形成分歧位点与抗体结合的夹心之式；即便有的类半抗原多肽可能会存在两个或以上的表位，但抗体造备中的现实是常很难获得针对分歧表位能够组成夹心配对使用的抗体，此种情况下，选择构建竞争性ELISA步骤令是一个因材施措的战术。有些分子量足较大、足够复杂的含有多个表位的具齐全抗原性的分子，如在仅一株单抗或仅有其多抗可被利用的现实前提下，也需思考选择设计竞争性的检测步骤；当然，对于具备前提选取夹心法检测的齐全免抗原性抗体或蛋白分子，有的情况下有关钻研人员仍思考使用竞争性ELISA步骤进行测定也不是未尝不成。
若何基于自己可利用的抗体试剂现实情况、地点尝试室具体的平台前提，综合评估指标钻研的试验设计，基于竞争性ELISA道理成功成立一个 “Fit-for-Purpose”的分析步骤，也是临床前和临床PK或PK/PD评价钻研中一个具体又现实的技术性问题。
竞争性ELISA道理用于药物PK定量分析的步骤学设政战术
用于定量分析药物PK浓度的竞争性ELISA步骤通常有两种根基的Assay构建模式：
一种模式是以单抗或多抗作为固相捕获试剂，样品中游离（本文中游离特指非固相化）药物与象征药物竞争结合固相的抗体，如游离药物和生物素象征的药物竞争性结合包被在板孔的抗体（拜见图1）。
另一种模式就是将肯定浓度的药物包被在固相载体上，选取样品中游离药物与固相药物竞争性结合游离的抗体（若图2）。
这两种Assay模式在抗体药PK分析的利用上也能够转化为游离药物与象征药物竞争它们固相的靶点分子，或游离药物与固相药物竞争性结合象征的靶点分子；对于有的药物也还能够转化为对其受体分子的竞争性结合。具体设计时能够基于此两种Assay模式进行衍生或转化。
图1 游离药物与象征药物竞争的Assay模式
图2 游离药物与固相药物竞争的Assay模式
基于药物与象征药物竞争的这一模式，药物分子能够用辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）直接象征，这样的象征的药物重要用于对活络度要求不高且基于传统可见光吸收法检测平台的竞争性Assay开发；诖彻馕占觳馄教ㄒ材芄谎∪∩锼叵笳，借助链霉亲和素-生物素信号放大系统进行较高活络度Assay的构建。随着分子象征技术的发展和新平台的不休出现，如若必要开发更为活络的竞争性Assay，也能够选取荧光素象征药物分子成立荧光检测的步骤，或可选取镧系元素中的Eu(铕)象征药物基于功夫分辨荧光平台进行检测，如有MSD平台的分析尝试室还能够利用该公司的SULFO-TAG象征药物分子开发电化学发光的检测步骤。选取象征药物和非象征药物竞争的模式，选择什么样的象征分子，产生什么类型的信号，能够基于自身尝试室平台前提或仪器所占有的检测职能？楹拖质当匾幕盥缍燃跋笳鞯目尚行郧榭鲋葱芯咛宓恼绞。
选取游离药物与固相药物竞争的模式时，一个优势是通Ｄ芄幻馊ソ蟹肿酉笳鞯穆榉，节约了象征成本，出格是当象征不足可行性时，如有些药物分子不足与象征物相结合的基团或药物分子被象征后其自身的不变性或其它基团受到了影响的情况下选取此种竞争法是一种很好的应对战术。然而，有时实际中我们会发现药物直接包被在固相载体上限度了其与非固相抗体的有效结合，Assay的整体信号不容易上去，活络度可贵到提高档景象，可能是固相化后其表位受到了影响。然而，将非象征的药物直接固相化刷新为间接固相化，这种结合反映被影响的情况有时会得到改善，如在象征可行的情况下，先将药物进行生物素象征，使生物素象征的药物与固相载体上包被的Streptavidin结合间接实现药物固相化再与游离药物竞争（拜见图3）。分析人员能够自行包被Streptavidin，也能够采办贸易化的包被有Streptavidin资料直接利用，如Thermo和MSD等公司均有贸易化的Streptavidin Coated Plate提供。
图3 游离药物与间接固相化药物竞争的Assay模式
分析步骤学模式的构建要结合具体尝试室的平台前提、可供利用的抗体情况、药物分子的结构与性质、指标钻研对活络度和步骤检测领域的合用性要求等成分来造订具体战术。
竞争性ELISA道理当用于药物PK分析步骤学成立的实际性重点
竞争性反映系统的组成
竞争性Assay的一个主题道理就是“竞争”，因而实际此类步骤成立的主题重点就是拥有竞争性特点的抗原抗体反映系统的组成，即是要营造一个能促成“竞争”产生的ELISA反映系统。上述两种根基的竞争性ELISA Assay Format，都由三个重要成分组成，即：游离药物、象征药物或固相化药物、抗体。这三大重要成分，我们能够别离把其概想化为：竞争因子、被竞争因子、资源因子。
这三大因子是组成竞争性环境即反映系统的必须。象征药物或固相化于载体的药物在反映系统中浓度是固定的；而样品中游离药物浓度长短固定的，出格是PK定量分析步骤中要用到尺度曲线，被测样品中游离药物与组成尺度曲线的分歧浓度梯度的游离药物都是要与象征药物或固相化于载体的药物竞争性结合系统中的抗体，因而反映系统中抗体能够说是竞争性Assay中的“资源因子”；游离药物与象征药物或固相化于载体的药物互为竞争和被竞争的关系，为便于论述，此文中我们把游离药物称为“竞争因子”、象征药物或固相化于载体的药物称为“被竞争因子”，其实两者互为彼此的竞争因子。
营造竞争性反映系统的基础
在微观世界里的一些分子间的相互影响或作用其实与宏观世界甚至人类世界里的景象是拥有共通的处所，在某种资源有限的情况下，人与人间就会发生对该有限资源的争抢即竞争性地占有资源。同样，竞争性Assay反映系统中竞争因子与被竞争因子间的竞争关系发生基础就是“资源有限”，对于竞争性ELISA而言就是抗体有限或具体说抗体所含的药物总结合位点有限。若是抗体量过多或所谓鼓和，则不能造成游离药物与象征药物或固相化药物的竞争，这样的竞争性ELISA反映系统则是失灵的。
表1和图4为一个在成立中的某低分子药物的竞争性ELISA PK Assay案例（案例一），凭据给药剂量、方式等预测必要开发一个定量领域在0.391-25ng/mL的分析步骤，选取的是固相药物和游离药物竞争性结合其单克隆抗体的模式。统一批配造起源的尺度曲线，当抗体浓度（此处以现实使用时的稀释倍数显示）极度高时（1/500），分歧浓度的尺度品的信号值无梯度性变动和显著差距，此情况下，抗体浓度过高没有造成游离药物竞争滋扰掉固相药物与抗体的结合而不能使信号呈浓度梯度依赖性的差距变动。其它前提都一样时，降低单抗稀释倍数到1:2000，标曲高浓度点间分歧浓度梯度的尺度品的信号值差距起头显著出现，预示竞争产生；当持续降低单抗稀释倍数至1:5000，这种浓度梯度依赖性的信号差距则更为显著，标曲拟合趋向向好。
表1：案例一中调节固相化抗体浓度后对步骤阐发的影响
图4:表1对应的3个分歧前提下的尺度曲线
竞争因子间的调控
对于一个竞争性ELISA Assay而言，除了仅提供有限的“资源因子”，还需思考到“竞争因子”与“被竞争因子”间的权势大幼问题，即互为竞争对象的两者间不能出现竞争绝对权势方。绝对权势方会因其绝对优势而导致对应的竞争方毫无对其滋扰的能力。对于这一点人类世界的景象和微观世界的景象同样是相通的。如两个不相上下的人格斗时能够僵持很久，当一幼我与两幼我同时格斗时也可能会对峙一段功夫，当一幼我同十几幼我同时格斗时由于力量对比悬殊，毫无匹敌能力可言，极易瞬间被对方击溃，甚至连出招抵抗的机遇都没有。竞争性ELISA步骤成立时，若是作为被竞争因子的固相化药物或象征药物比例或浓度过高，则导致作为“竞争因子”的游离药物不会或险些不会对被竞争因子与抗体结合的滋扰，尺度曲线的分歧浓度尺度品间的信号梯度不能出现或不显著，尺度曲线难以拟合或拟合质量不高而不具备较好的对未知样品的丈量分辨力，进而影响对现实的样品真实正确定量。因而，实际中客服这一问题时要把稳参加反映的竞争因子间比例调控。
观察竞争性因子的竞争能力，能够通过将样品信号值归一化为结合百分比（B/B0）来观察,则竞争因子滋扰被竞争因子与抗体结合能力更显直观。实际中常见的就是仅在几个高浓度标曲点上出现了结合百分比的梯度依赖性差距，低浓度点的B/B0无显著差距或险些不变，即低浓度尺度品不能很好地参加标曲拟合，此种情况下通常是被竞争性因子相对于低浓杜孜离药物而言仍占据了绝对优势，从而影响了步骤的检测活络度，能够尝试调低被竞争因子的使用浓度或比例。如表2和图5所示案例二：该步骤为一个抗体药物的竞争性ELISA步骤，Assay Format为游离药物与生物素象征药物竞争其抗怪异型抗体，统一批配造起源的标曲，在生物素象征药物稀释比例为1/30000时，几个高浓度标曲点上出现了结合百分比的浓度梯度依赖性差距，但低浓度水平的尺度品B/B0险些无差距，标曲低浓度端趋平缓，拟合不梦想，其低浓度质控品的正确度也受到影响；当生物素象征药物稀释比例为1/40000时，低浓度水平的尺度品B/B0差距显著，标曲得到了很好拟合，来自于统一配造的低浓度质控品的正确度也趋好。
表2：案例二中分歧生物素象征药物比例下的步骤阐发的比力
图5:表2对应的2个分歧前提下的尺度曲线
平衡性竞争系统与非平衡性竞争系统的利用
在社会生涯中，我们时时听说不合等竞争或不平正竞争。竞争性ELISA Assay同样能够有对等的竞争和不合等的竞争，此文将其概想化为平衡竞争法和非平衡竞争法。
平衡竞争法中是同步开启“竞争因子”与“被竞争因子”对“资源因子”如抗体的结合反映，在象征药物与非象征药物的竞争性Assay Format中，将象征药物与非象征药物同步或险些无时差性参与到已包被有抗体的固相载体中实显旖衡的竞争；在游离药物与固相药物的竞争性Assay Format中，先将含游离药物的样品参与已包被药物的固相载体中，再行参与抗体实显旖衡的竞争。
反之，非平衡竞争法中则长短同步开启“竞争因子”与“被竞争因子”对“资源因子”如抗体的结合反映；在象征药物与非象征药物的竞争性Assay Format中，能够先将象征药物或非象征药物参与到已包被有抗体的固相载体中，反映一段功夫后再参与另一非象征药物或象征药物实现非平衡式竞争；在游离药物与固相药物的竞争性AssayFormat中，先将含游离药物的样品与抗体在单独的载体中混合反映一段功夫后，再参与到已包被药物的固相载体中，或先将抗体参与到已包被药物的固相载体上，反映一段功夫后，再将含游离药物的样品参与其中参加反映实现非平衡式竞争。通常来说，钻研人员习惯于平衡性竞争法的操作流程，但有的情况下采取非平衡的竞争法，有利于Assay机能的优化。
如表3和图6中的案例三，选取的是固相抗原和游离抗原竞争性结合抗体的模式定量检测某多肽药物，此例中的标曲与QC也起源于统一批配造。其它前提都一样的前提下，当将游离药物与抗体先混合一路反映一段功夫后参与包被有药物的微孔板中，则该分析步骤的阐发要比先将游离药物参与包被有药物的微孔板中再立即参与抗体的平衡性竞争方式好好多。非平衡性竞争法中的标曲低浓度点间的B/B0间差距更为显著，尺度曲线拟合质量更佳，QC的正确度靠得住，而非平衡性竞争中不仅标曲低浓度端平缓，同样起源的QC也阐发欠安。
表3 案例三中平衡性竞争与非平衡性竞争的比力
图6:表3对应的2个分歧前提下的尺度曲线
结语
综上所述，竞争性ELISA法用于PK定量分析是相对较难的一种步骤，具体实际中若要利用好这一步骤，始终要基于“竞争」剽一底子道理发展反映系统的构建与优化。由于分子间的竞争与相互作用，都是肉眼无法看到的微观世界里的行为，将宏观世界或说人类世界的景象发散到对微观世界中个别间关系和作用的设想与思虑中，未免不是一个借鉴性思想方式。同人类世界类似，实际中无论是基于哪种竞争性分析模式，首先要营造好竞争性的环境，即提供有限的资源引发竞争；还要推进差距化的“竞争”成效的产生，对于竞争性ELISA步骤，竞争性因子间无需不相上下，但要预防拥有绝对优势的竞争因子出现。为便于论述，上述内容重要基于传统的竞争ELISA检测模式进行了举例和论述，文中这些实际性的战术和重点能够结合一些新的平台进行衍生和优化使用，并也能够拓展到对内源性分子的检测中，笔者的尝试室都有着各类衍生性的竞争性ELISA步骤的具体实际，道理相通，不再逐一举例。此表，作为PK定量的ELISA步骤同常用到的其它PK定量法一样，步骤成立后也必要进行各类后续参数的优化与验证，已有好多有关文件论述，因而本文不再赘述，把握好本文提出的战术和重点，将会为后续各参数的顺利优化和验证奠定一个优良基础。
（未经许可，文章内的所有图片和数据不得引用）
作者简介
章登吉，本硕博别离就读于安徽师范大学、上海师范大学&中国农业科学院上海兽医所和复旦大学，主攻方向为大分子药物与细胞基因医治药物的分析与评价。曾任职上海药明康德大分子生物分析部多年，参与新利luck18后创建了生物技术药物分析团队，现为新利luck18普亚生物技术药物生物分析部门掌管人，拥有13年多的临床和临床前生物技术药物分析经验，掌管过Novartis, Pfizer, Lilly, J&J, Genentech, Medimmune, Takeda，石药集团等多家医药企业的多类型生物药有关分析评价工作。在生物技术药的药代动力学、毒代动力学、免疫原性及生物标志物有关的分析方面有着丰硕的理论基础和实际经验，撰写有关文章多篇，作为第一发现人申请有关国度发现专利五项，有三项已经获得授权。
尝试室简介
新利luck18生物技术药物的生物分析尝试室占有SpectraMaxM4/M5/i3x, MSD S600, Luminex, Biacore 8K, Envision, Gyrolab，Covaris E220R， ABI7500 qPCR仪等全方位多职能的技术平台，提供全面切合FDA/CFDA GLP，GCP规范的生物技术药物生物分析服务，以支持蛋白药物、抗体药物、ADC药物、多肽药物、核酸药物、细胞基因医治药物的早期筛选与开发，及其临床前和临床有关钻研。
关于新利luck18
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